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高分子結(jié)合物含置測(cè)定法

本法系利用高分子結(jié)合物、低分子結(jié)合物及游離多糖在

不同乙醇濃度下，沉淀分離，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)

定磷含量，計(jì)算髙分子結(jié)合物的含量。

試劑 （1) 5m o l/L氣化鈉溶液精密稱定氯化鈉

2 9 .2 2 g ,加水溶解并稀釋至1 0 0m l,室溫保存。

(2 )1 .5m o l/L硫酸于1體積98%的硫酸中加人1 1體

積的水，混勻。

(3)2. 5%鉬酸銨稱取鉬酸銨2. 65g, 加水溶解并稀釋

至 100mlo

(4)10%抗壞血酸稱取抗壞血酸10g, 加水溶解并稀

釋至100ml。

(5 )礦化試劑硫酸與70%高氯酸等體積混合制得。

( 6 )產(chǎn)色試劑水、1 .5m o l/L硫酸、2 .5% 鉬酸銨、

10%抗壞血酸，按2 : 1 : 1 : 1體積比混合配制.

(7)8(Vg/ml磷對(duì)照品貯備液精密稱定經(jīng)100°C干燥的

磷酸氫二鈉0. 3665g或磷酸二氫鉀0 .3 5 0 9 g ,加水500ml、

5mol/L硫酸溶液10ml溶解，補(bǔ)加水至1000ml。臨用時(shí)，將

貯備液做20倍稀釋，即為磷對(duì)照品工作液。

(8 )1 .0m o l/L氫氧化鈉溶液稱取4 g氫氧化鈉，加水

溶解并稀釋至100ml。

供試品溶液的制備（1)分步沉淀原液用生理氯化鈉

溶液稀釋至多糖含量20?2 8 ^ 7 ^ 1或成品疫苗3ml，加人

3120 人血液制品中糖及糖醇測(cè)定法

5m o l/L氯化鈉溶液0. 7 5 m l,混勻后加人無(wú)水乙酵15ml，于

一20X；冰箱放置72?96小時(shí)，以每分鐘8000 ^ 4X：離心90

分鐘，吸取上清液為供試品溶液2 ; 于沉淀中加人50%乙醇

溶液0 .5 m l,加玻璃珠，混合后室溫放置1 小時(shí)；再加人

50%乙醇溶液1.5ml，混合后室溫放置2 小時(shí)，然后以每分

鐘8000轉(zhuǎn)8°C離心1小時(shí)，吸取1. 8m l上清液為供試品溶液

3 ; 沉淀再加人l.O m o l/L氫氧化鈉溶液0.5ml, 混合后室溫

放置1小時(shí)，加水1.25ml，作為供試品溶液4。

(2)取多糖含量20?28Mg /m l的原液或成品疫苗1. Oml

為供試品1。

(3 )供試品溶液的礦化分別量取1 .0m l供試品1、

1 .5m l供試品溶液2、0 .7m l供試品溶液3、0 .5m l供試品溶

液4 各2 份；分別加人礦化試劑0. 1 5 m l,置150°C干燥1小

時(shí)，然后升溫至180X：干燥3 0分鐘，再升溫至250°C干燥1

小時(shí)。

測(cè)定法量取水1 .9 5 m l,加礦化試劑50^1后加2.0ml

產(chǎn)色試劑，混勻后置37T：水浴2 小時(shí)，在波長(zhǎng)8 2 5 m n處測(cè)

定吸光度，作為空白對(duì)照。

于礦化好的供試品溶液中加水1.85ml，加產(chǎn)色試劑

2.0ml，混勻后置37TC水浴2 小時(shí)，在波長(zhǎng)825nm處測(cè)定吸

光度。

分別量取磷對(duì)照品工作液0. 1ml、0. 2ml、0. 4ml、

0.8ml、1 .0m l于試管中，每管依次加水1. 85ml、1.75ml、

1.55ml、1.15ml、0. 95ml；然后每管分別加入礦化試劑

5 0 f i l后加2. Oml產(chǎn)色試劑，混勻后置37°C水浴2 小時(shí)，在

波長(zhǎng)825nm處測(cè)定吸光度。

結(jié)果計(jì)算以磷對(duì)照品溶液的濃度對(duì)其相應(yīng)的吸光度作

直線回歸，求得直線回歸方程。將供試品溶液的吸光度代人

直線回歸方程，求出磷含量。

供試品磷含量(Fg /tn l)分別為：

P ^ C A j X S ) / ! . 0

P2 = CA2 X 18. 75)/l. 5

P3 = (A3X2. 0)/0. 7

P4 = (A t X 2. 0)/0. 5 - (P s X10)/100

試驗(yàn)有效性8 0% <朽/ ( 尸2+ 朽+ 尺）<120%

供試品高分子結(jié)合物含量（％) = P 4/ ( 朽+ P 3 + P , ) X 100

供試品游離多糖含量(％ ) = [1 — / (P2 + P 3 + P 4) ] X 100

式中 f V P2, P3、P4 為供試品1，供試品溶液2，

供試品溶液3 , 供試品溶液4 的磷含量；A 、A 2、A 3、A,

為供試品1 , 供試品2 , 供試品3 , 供試品4 中取樣礦化后的

磷含量。